Het driekleurig viooltje is als geneeskruid door Rembert Dodoens (1554) voor het eerst beschreven. De soort werd gebruikt bij kinderziekten en bij kwalen van de luchtwegen. In Engeland werd het veel gebruikt bij hartkwalen, krampen in de borst en borstvliesontsteking. Vroeger werd de plant als geneesmiddel gebruikt omdat deze pijnstillend en slijmoplossend zou zijn. In fytotherapie wordt het driekleurig viooltje gebruikt tegen huidaandoeningen zoals dauwworm en eczeem. Een oude legende vertelt het verhaal van het viooltje dat een verleidende en betoverende geur had. De mensen konden de geur niet weerstaan en moesten gewoon aan het viooltje ruiken. Hierbij vertrapten de mensen het graan en koren rondom het viooltje. Dit stemde het plantje verdrietig en het bad tot God om haar de verlokkende geur te ontnemen. Sindsdien heeft het viooltje geen geur meer... In Shakespeares A Midsummer Night's Dream brouwt Oberon een liefdesdrank van het driekleurig viooltje. Heinrich Witte (1829-1917), Nederlands botanicus en publicist, publiceerde in 1875 zijn novelle Het driekleurige viooltje, waarin hij verhaalt hoeveel plezier het vinden van de plant hem geeft tijdens een wandeling in de omgeving van Bennekom.